Développement d’un test de diagnostic rapide du choléra ciblant à la fois Vibrio cholerae et le vibriophage

Le choléra est une maladie diarrhéique aiguë aqueuse qui peut entraîner une déshydratation sévère et la mort en moins de 16 heures. Il constitue un problème majeur de santé publique en Asie, en Afrique et en Amérique latine. À l’échelle mondiale, on estime que 1,3 à 4 millions de cas et 21 000 à 143 000 décès surviennent chaque année en raison du choléra¹. Un diagnostic précis et précoce du choléra, dès le début d’une épidémie, est essentiel pour réduire la morbidité et la mortalité.

Les tests de diagnostic rapide (TDR) ont le potentiel de fournir des résultats objectifs immédiats au début des flambées épidémiques, notamment dans des contextes dépourvus de laboratoires de microbiologie conventionnels. Plusieurs TDR basés sur des immunoessais à flux latéral sont disponibles dans le commerce et ciblent des antigènes spécifiques de Vibrio cholerae O1 et/ou O139. Toutefois, les performances de ces TDR sont imprévisibles pour des raisons encore mal comprises, ce qui a limité leur adoption. Nous nous intéressons particulièrement au TDR largement utilisé commercialisé sous le nom de Crystal VC (Span Diagnostics, Inde), développé par l’Institut Pasteur.

Bien que les limites des TDR actuels puissent inclure des problèmes liés à la production ou à l’opérateur, il existe plusieurs raisons biologiques expliquant leur défaillance lors du déploiement sur le terrain. L’une des explications est que la concentration de Vibrio cholerae peut chuter en dessous du seuil de détection lorsque la bactérie est prédatée par des virus appelés vibriophages lytiques. Cette prédation est dynamique et dépend du rapport prédateur/proie. Nous avons montré que le vibriophage (ICP1) a un impact négatif sur les performances des TDR (voir la section des données préliminaires).

Notre principale question de recherche est de savoir si l’intégration d’anticorps capables de détecter à la fois V. cholerae et les vibriophages lytiques dans un test de diagnostic rapide permettrait de surmonter les limites des TDR actuellement utilisés lorsque les patients atteints de choléra hébergent des vibriophages lytiques. Ce TDR innovant pourrait constituer un modèle pour le développement d’outils diagnostiques pour les maladies infectieuses entériques et non entériques. Afin de développer ce TDR et de répondre à cette question, nous proposons les objectifs spécifiques suivants :

Objectif spécifique 1

Identifier les protéines structurales et non structurales des vibriophages lytiques qui sont antigéniquement uniques dans les selles diarrhéiques. Nous émettons l’hypothèse que les vibriophages lytiques expriment des protéines structurales et non structurales antigéniquement uniques. Ces protéines pourront être utilisées pour générer des anticorps monoclonaux (AcM) qui seront ensuite intégrés dans un TDR amélioré.

Nous adopterons deux approches pour identifier des protéines immunogènes uniques des vibriophages, avec un accent particulier sur ICP1, car il s’est avéré être le plus fréquemment détecté dans plusieurs régions.

1.1

Vaccinologie inverse par analyse génomique, clonage, expression et évaluation de l’immunogénicité

1.2

Analyse protéomique des protéines immunogènes séparées par électrophorèse bidimensionnelle (2D) et identifiées par MALDI-TOF

Objectif spécifique 2

Produire des anticorps monoclonaux (AcM) dirigés contre des protéines uniques de vibriophages lytiques. Les protéines de vibriophages identifiées dans l’objectif 1 seront utilisées pour produire des AcM en utilisant à la fois les techniques d’hybridomes et d’ascite in vivo.

2.1

Immuniser un modèle animal avec les protéines de vibriophages et cribler les clones d’hybridomes producteurs d’anticorps

2.2

Multiplier in vivo les cellules d’hybridomes sélectionnées par la méthode d’ascite pour la production et la purification par affinité des AcM

Objectif spécifique 3

Produire, tester et sélectionner des TDR candidats présentant les meilleures performances. Les anticorps monoclonaux produits par la technologie des hybridomes seront utilisés pour développer un test à flux latéral basé sur un immunoessai ; ce test inclura l’AcM commercial existant (ou équivalent) dirigé contre le LPS de V. cholerae O1. Plusieurs TDR utilisant différents AcM candidats seront évalués.

3.1

Conjuguer l’or colloïdal aux AcM et assembler la bandelette à flux latéral

3.2

Évaluer les performances des TDR par comparaison avec des TDR commerciaux à l’aide d’une collection d’échantillons cliniques

Il est probable que les tests de diagnostic rapide (TDR) pour le choléra échouent par intermittence parce que les vibriophages lytiques détruisent la cible Vibrio cholerae. Dans cette proposition, nous ajoutons un anticorps au vibriophage lytique (ICP1) au TDR. L’objectif est que la détection du vibriophage puisse servir de substitut au Vibrio cholerae et, par conséquent, augmenter la sensibilité du TDR en présence de vibriophages.

Ce test de diagnostic rapide révisé répondra aux préoccupations relatives à la sensibilité et aux performances intermittentes des tests de diagnostic rapide actuels en présence de vibriophages lytiques. Ce nouveau test de diagnostic rapide ne remédiera pas aux limites liées à la présence d’antibiotiques. Par conséquent, les rapports des patients sur leur consommation d’antibiotiques devront être pris en compte lors de l’évaluation des résultats du test de diagnostic rapide, même avec le nouveau test.